UPLC特征图谱为鉴别重楼真伪提供新选择

发布者:admin 发布时间:2019-10-30 08:38 浏览次数:

  重楼药材及饮片为《中国药典》2015年版一部收载品种,为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎,具有悠久的药用历史。

  近年来,我国重楼的生长环境遭到破坏,植物繁殖率低,资源再生较慢,各产区药材蕴藏量普遍下降,且市场上的云南重楼饮片存在混伪品。因此,需要建立一种可以有效鉴别云南重楼的分析方法,以控制重楼药材及饮片的质量。

  药材:云南重楼(编号为1~10)、华重楼(编号为11~13)、伪品(编号为14~20),样品经中国食品药品检定研究院鉴定。

  试药:伪原纤细薯蓣皂苷(批号:Y19F7H9835,纯度98%)、重楼皂苷H(批号:Y21A9H68360,纯度98%)、纤细薯蓣皂苷(批号:CF0227QC14,纯度98%)、重楼皂苷Ⅴ(批号:Y19F7H9835,纯度98%)、重楼皂苷Ⅶ(批号:11,纯度94%)、重楼皂苷Ⅵ(批号:11,纯度98%)、重楼皂苷Ⅱ(批号:11,纯度96.1%)、薯蓣皂苷(批号:11,纯度91.4%)和重楼皂苷Ⅰ(批号:11,纯度93.6%)。

  对照品溶液:分别精密称取伪原纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ对照品适量于1ml量瓶中,以甲醇定容至刻度,即得各对照品储备液。分别取各对照品储备液适量于量瓶中,甲醇定容至刻度,即得对照品单标溶液。

  供试品溶液:本品粉末(过三号筛)约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,加热回流30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。

  精密度试验:按照色谱条件与系统适应性试验的色谱条件,精密吸取同一供试品溶液,连续进样6次,每次10μl,所得特征峰的相对保留时间的RSD(相对标准偏差)均<0.78%,特征峰的相对峰面积RSD均<2.28%(n=6),表明仪器精密度良好。

  稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液,于配制后的0、4、8、12、16、24小时进样,所有特征峰的相对保留时间的RSD均<1.13%、相对峰面积的RSD均<2.56%(n=6),表明供试品溶液在配制后24小时内稳定。

  重复性试验:取同一批号样品,按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液,依法测定,所得特征峰的相对保留时间的RSD均<0.96%,特征峰的相对峰面积的RSD均<2.87%(n=6),结果表明本方法重复性较好。

  取10批云南重楼样品粉末,精密称定,制备供试品溶液,精密吸取10μl,分别进样测定,记录35分钟的UPLC(超高效液相色谱)色谱图。采用ChemPattern化学计量学软件对实验室数据进行分析处理,设定样品1、3、7、10为代表性图谱生成共有模式图,将其他样品的色谱峰与共有模式图进行自动匹配,生成云南重楼的特征图谱,计算样品1~10与特征图谱的相似度,结果表明,各批云南重楼正品之间的相似度均大于0.70,说明相似度良好。

  根据10批云南重楼的特征图谱检测结果,共标定8个特征峰。经过与对照品比对,并结合DAD光谱,可知1号峰为伪原纤细薯蓣皂苷、2号峰为重楼皂苷Ⅶ、3号峰为重楼皂苷H、4号峰为重楼皂苷Ⅱ、5号峰为薯蓣皂苷、6号峰为纤细薯蓣皂苷、7号峰为重楼皂苷Ⅰ、8号峰为重楼皂苷Ⅴ。

  取不同批次的华重楼(样品11~13)粉末,精密称定,制备供试品溶液,分别进样测定,记录35分钟的UPLC色谱图,图中主要包含3个峰,其中1号峰为重楼皂苷Ⅶ。华重楼与云南重楼特征图谱的主要区别为:云南重楼中具有较高含量的薯蓣皂苷类成分,如重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷等,而华重楼几乎不含上述成分。采用ChemPat tern化学计量学软件对实验数据进行分析处理,计算样品11~13华重楼与特征图谱的相似度,发现华重楼和云南重楼特征图谱差异大,存在显著不同。

  取不同批次的伪品(样品14~20)粉末,精密称定,制备供试品溶液,分别进样测定,记录35分钟的UPLC色谱图,图中主要包含3个峰,其中1号峰为重楼皂苷Ⅶ,3号峰为重楼皂苷Ⅵ。本实验中收集到的伪品与云南重楼特征图谱的主要区别为:云南重楼同时含有重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷和重楼皂苷Ⅰ,而伪品几乎不含上述成分。同时,重楼皂苷Ⅵ为伪品的主要成分,云南重楼和华重楼中几乎不含该成分。采用ChemPat ter n化学计量学软件对实验数据进行分析处理,计算样品14~20伪品与特征图谱的相似度,发现伪品和正品特征图谱差异大,存在显著不同,可用于重楼的鉴别和质量控制。

  将色谱仪采集的数据以*.cdf格式导出,再导入ChemPat t er n化学计量学软件,对相应的色谱峰进行积分,按样品对峰面积进行标准化处理,再进行聚类分析和主成分分析。分析数据显示,建立的特征图谱方法采用聚类分析和主成分分析均能够将云南重楼和其他样品(华重楼、伪品)分成2组,进一步再将华重楼与伪品分为2组,从而达到鉴别的目的。

  检验人员通过UPLC梯度洗脱法建立了云南重楼的特征图谱,获得了云南重楼化学成分的整体情况,且35分钟内完成分离。其主要成分伪原纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ的分离效果良好。此外,在通过二极管阵列检测器考察最适紫外吸收波长时,综合考虑8个主要成分的最大吸收,最终选择203nm为检测波长。

  经检验,10批云南重楼UPLC图谱与特征图谱之间的相似度均大于0.70,相似度良好,表明各批次云南重楼的化学成分种类、比例相似,而3批华重楼与特征图谱之间相似度为0.26~0.37,说明《中国药典》规定的重楼两个正品品种云南重楼和华重楼化学成分存在差异;7批伪品UPLC图谱与特征图谱之间相似度均小于0.22,相似度较低,与正品化学成分差异较大。由聚类分析和主成分分析结果可知,两种分析方式均能够将云南重楼、华重楼和伪品区分开来。

  由此可见,本实验建立的云南重楼特征图谱可以有效区分云南重楼、华重楼和伪品,为有效控制重楼质量提供了科学依据。【本文摘编自高妍 李德旺 过立农 马双成刘杰 郑健 昝珂.云南重楼UPLC特征图谱研究[J].中国食品药品监管.2019.9(188):38-44】

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